细胞培养与迁移实验流程

目的细胞根据标准细胞培养方案在血清培养基中进行培养。于检测前一天，使用无血清培养基（0.2% BSA）处理细胞。经过在无血清培养基中过夜培养后，吸除细胞培养基并用PBS冲洗；接着，加入胰蛋白酶溶液以启动细胞分离。将得到的细胞悬液转移至试管中，以350×g离心5分钟，然后将细胞重新悬浮于预热的细胞培养基中，最后将细胞悬浮液稀释至100,000个细胞/ml的接种密度。

诱导迁移实验的步骤

向接收板的每个孔中加入200μl含有或不含化学引诱剂的培养基。在这种情况下，可以使用不同浓度的FCS，从0.25%到10%不等。接着，将上述制备的细胞悬液加入膜板各孔中50μl，并在37℃、5% CO2培养箱中培养24小时。

荧光信号的检测

从接收板各孔中吸出培养基后，向接收孔中加入150μl无血清培养基及8μM的钙黄绿素AM（在DMSO中稀释），然后在37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养45分钟。培养结束后，从膜板和接收板的每个孔中再一次吸除细胞培养基，并用PBS冲洗两块板的孔。接着，向接收板中加入胰蛋白酶溶液，以使膜下侧迁移的细胞开始脱离。让胰蛋白酶溶液孵育10分钟，轻轻摇动后，将180μl每孔的胰蛋白酶细胞悬浮液转移至黑色96孔微孔板的每孔中。在激发波长为485nm、发射波长为520nm的读板器中读取荧光值。

细胞迁移的优化与监测

取出膜板各孔中的培养基后，使用预湿的棉签缓慢旋转棉签，以去除膜上部未迁移的细胞。使用绿色通道下的荧光显微镜检测膜下侧迁移细胞的荧光信号。此外，ThinCert®96孔HTS小室由于其独特的孔结构提供了高透明度，这一特性优于传统设备，使得活细胞的观察更加直观，进而能够评估细胞形态、融合状况以及可靠地进行污染监测。因此，在每次实验中，都需进行对细胞的连续显微镜监测。

迁移实验的重要性

体外细胞迁移实验作为研究更佳生物标志物、治疗靶点和药物干预肿瘤转移、血管生成及炎症性疾病等复杂现象的重要工具，提供了一个可控的环境，能够精确测量细胞的迁移行为，并分析不同分子如生长因子和趋化因子或候选药物的影响。在迁移实验中，孔径的恰当选择至关重要，孔径需与研究细胞的尺寸成比例，以确保既能限制细胞的被动移动，又能促进其主动迁移。以下推荐了一些常用的膜孔径选择建议。

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